组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法，采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。
目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞，并进行成脂、成骨的诱导分化。
方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞，进行体外培养，观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞，用MTT法绘制其生长曲线；流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况；分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化，油红O、茜素红染色定性鉴定。
结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态，生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示，第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29，CD44，阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后，油红O染色阳性；成骨诱导培养14 d后，茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 培养, 组织块贴壁培养, 细胞鉴定, 诱导分化, 成脂诱导, 成骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: The rabbit adipose-derived stem cells are mostly isolated by type I collagenase digestion, but rarely by explants culture method.
OBJECTIVE: To isolate rabbit adipose-derived stem cells for adipogenic and osteogenic differentiation.
METHODS: The rabbit adipose-derived stem cells were isolated from rabbit adipose by explants culture method, and cultured in vitro followed by morphological observation. The grow curve and cell surface markers CD29, CD44, CD45 of passage 3 cells were analyzed respectively by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide and ?ow cytometry; cells from the third passages were induced for adipogenic and osteogenic differentiation by different revulsants, and cells were examined by oil red O staining and alizarin red staining .
RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit adipose-derived stem cells cultured in vitro exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand. Flow cytometry analysis revealed that the third passage of rabbit adipose-derived stem cells was positive for CD29, CD44, but negative for CD45. Rabbit adipose-derived stem cells were positive for oil red O staining at 14 days of adipogenic induction, and positive for alizarin red staining at 14 days of osteogenic induction. In conclusion, we could successfully isolate rabbit adipose-derived stem cells using explants culture method.

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Key words: stem cells, phenotype, adipogenesis, adipose tissue, flow cytometry

中图分类号:

R94.2

刘琴，王丽平，喻晶，陈芳，刁波，张宜. 组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 88-93.

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图/表（结果） 3

2.1 兔脂肪干细胞的生物学特性 组织块接种2 d后，在光镜下可见较少的细胞从组织块中移行出来，形态多为梭形，少数为圆形。贴壁后三至四天，在光镜下可见更多的细胞从组织块中移行出来，细胞大小较均一，形态多为典型的长梭形，偶见多角形，向四周呈单层贴壁生长(图1A)。7 d时去除组织块。12 d后，细胞数量增多，形态变为均一的梭形，达到80%左右的融合(图1B)。

细胞传至P3时，可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布，呈明显的旋涡状生长(图1C)，初步判断这些贴壁生长的成纤维样细胞就是兔脂肪干细胞。

四五天传代1次，可长期稳定传代。传代后大部分细胞五至六小时贴壁，12-24 h开始生长，4 d左右达到80%-90%融合。

2.2 传代细胞的增殖能力 用MTT法检测第3代细胞增殖能力。结果显示，培养的细胞增殖能力强，经2 d的潜伏期后在第4天进入对数生长期，随着培养时间的增加而增殖，第7天进入平台期，细胞生长曲线呈典型的“S”形 (图2A)。

2.3 细胞表型分析 流式细胞仪分析第3代细胞的细胞表型。结果显示，组织块贴壁法培养得到的细胞强烈表达间充质干细胞相关标志物CD29，CD44，阳性率分别达98.9%，98.8%；低表达造血干细胞相关标志物CD45，阳性率低于5%(图2B)。

结果表明分离培养的兔脂肪干细胞是具有均一细胞表面特征的细胞群。

2.4 成脂诱导分化 为鉴定组织块贴壁法培养获得的细胞向脂肪细胞的分化能力，取P3细胞，做成细胞爬片，加入成脂分化诱导液培养，诱导3 d后少量细胞形态由长梭形逐渐变为多角形、不规则形。诱导6 d后胞浆内出现少量脂滴(图3A)。11 d时细胞形态变为明显的多角形、不规则形，细胞内出现大量的脂滴(图3B)。2周时小心吸弃诱导培养液并用40 g/L多聚甲醛固定后加入油红O染色，细胞内出现大量红染颗粒(图3C)。对照组细胞无明显变化(图3D)。表明获得的细胞可被诱导向脂肪细胞分化。

2.5 成骨诱导分化 为鉴定组织块贴壁法培养获得的细胞向成骨细胞的分化能力，取P3细胞，做成细胞爬片，加入成骨分化诱导液培养，诱导五至六天后，可见细胞部分形态由长梭形变为多角形、不规则形、类圆形(图3E)。11 d后可见多角形、不规则形细胞堆积，呈明显的簇状生长(图3F)。2周时小心吸弃诱导培养液并用40 g/L多聚甲醛固定后加入茜素红染色可见桔红色的钙结节(图3G)。对照组细胞无明显变化(图3H)。表明获得的细胞可被诱导向成骨细胞分化。

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引言

材料方法

设计：细胞形态学观察实验。

时间及地点：于2012年11月至2013年2月在解放军广州军区武汉总医院医学实验科完成。

材料：健康新西兰大白兔2只，雌雄不限，体质量2.5- 3.0 kg，由武汉大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：00024737。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

原代细胞的分离和传代培养：兔以10%的水合氯醛 (2 mL/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧固定于手术台上，手术区脱毛备皮，碘酒和体积分数75%乙醇依次消毒，铺单，取股沟处脂肪组织，移入超净台上，PBS漂洗3次，尽量清楚组织中肉眼可见的小血管和筋膜，用眼科剪剪碎至糜状。PBS清洗糜状组织，800 r/min离心5 min，去掉下层液体，重复2次。吸取上层组织块放于25 cm²玻璃细胞培养瓶中，稍稍倾斜细胞瓶去除吸取组织块时带进去的PBS，并将组织块均匀地铺在细胞瓶中，置37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱内培养。30 min后组织块贴壁于培养面，轻柔地加入2.0-3.0 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基浸润组织块，继续培养。每天观察细胞生长情况，每2 d或3 d更换培养液，7 d时刮除组织块。倒置显微镜动态观察原代和传代培养的兔脂肪间充质干细胞生长的形态、结构变化。待细胞增殖到80%-90%融合时用0.25% trypsin-EDTA进行1∶3传代，记为第1代细胞(P1)，方法参照文献[6]。

细胞免疫表型的流式细胞分析：消化收集对数生长期的第3代细胞，细胞计数，分成每管含5×10⁵细胞，800 r/min离心2 min，去上清，每管加入100 μL PBS重悬细胞，加入结合有PE的抗CD29，CD44，CD45抗体和相应的同型对照10 μL，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。

MTT绘制生长曲线：取兔脂肪干细胞单细胞悬液，调整细胞浓度约1×10⁷ L^-¹，接种于96孔板(200 μL/孔)，并设调零孔和对照孔，连续测8 d。从接种后的第2天起，每天同一时间取样，用PBS冲洗2次，各滴加50 μL MTT溶液 (5 g/L)，37 ℃孵育4 h后吸弃各孔内的液体，加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，采用酶标仪在490 nm波长测定各孔吸光度值(A)，计算出各组的均值，以时间(d)为横坐标，A为纵坐标，绘制生长曲线。

细胞分化潜能的鉴定：根据成脂、成骨分化诱导试剂盒说明书介绍的方法，消化收集对数生长期的第3代细胞(P3)进行体外分化实验，然后分别进行油红O染色、茜素红染色。分别设非成脂组及非成骨组进行对照。

主要观察指标：①原代及传代兔脂肪间充质干细胞生长的形态、结构变化。②第3代兔脂肪间充质干细胞表面抗原成分的检测。③兔间充质干细胞油红O染色、茜素红染色的定性分析。

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讨论

兔脂肪干细胞是体外研究骨组织工程的一种较为理想的种子细胞，目前主要以酶消化法分离培养兔脂肪干细胞，但酶的种类、浓度、消化时间存在很大差异，大多数文献采用Ⅰ型胶原酶消化分离原代细胞，少数采用Ⅱ型胶原酶、胰酶或者胶原酶联合应用胰酶进行消化分离，酶的使用浓度从0.75-2.5 g/L不等，消化时间范围为0.5-3 h^[7-8]。原代细胞培养的另一种方法组织块贴壁法已被成功用于从人脐带^[9-10]、皮肤^[11]、牙髓^[12]、脂肪等组织中分离出间充质干细胞^[13]。通过组织块贴壁法可相对简单而广泛地从组织中获得间充质干细胞。Ishige等^[14]甚至证明，从脐带分离间充质干细胞时，组织块贴壁法比胶原酶消化法更加优越。因此，有必要对组织块贴壁法分离兔脂肪干细胞进行探索。

3.1 兔脂肪干细胞的分离与培养 脂肪干细胞的分离培养方法尚没有公认规范统一的标准。分离兔脂肪干细胞通常采用胶原酶、胰蛋白酶消化脂肪组织法，酶消化法分离得到的细胞是一个高度混合的细胞群体，不同的研究者认为此细胞群体由不同的细胞种类组成。Miranville等^[15]首次对采用酶消化法分离得到的原代细胞种类进行了研究，研究认为细胞群体包含大量的CD34⁺细胞，且CD34⁺细胞包括2个细胞亚群。Yoshimura等^[16]认为该细胞群体由潜在的脂肪干细胞、内皮细胞、周细胞、血液来源细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、前体脂肪细胞等组成。Brzoska等^[17]认为由11% CD2⁺细胞、18% CD11a⁺细胞、29% CD14⁺细胞、49% CD31⁺细胞、57% CD45⁺细胞、60% CD90⁺细胞组成酶消化法分离得到的原代细胞群体。脂肪干细胞的培养体系常采用DMEM-L+体积分数10%胎牛血清、DMEM-F12+体积分数10%胎牛血清、α-MEM+体积分数10%胎牛血清。然而，已有研究表明培养间充质干细胞的基础培养基、葡萄糖浓度、胎牛血清的质量与浓度、细胞接种密度影响实验结果^[18-19]。如间充质干细胞培养液的组成干扰干细胞相关转录因子NANOG，Oct-4，Sox-2，Rex-1的表达^[20]。

实验采用组织块贴壁法分离培养兔脂肪干细胞。从新西兰大白兔股沟皮下脂肪组织中分离得到脂肪组织块，在DMEM-L+体积分数10%胎牛血清，37 ℃，体积分数5%CO₂条件下培养，兔脂肪组织块贴壁后三至四天，在光镜下可见细胞从组织块中移行出来，细胞大小较均一，形态多为典型的长梭形，偶见多角形，因经费有限，未对从组织块移行出来的原代细胞的种类进行研究。传代后，细胞形态主要为长梭形，融合时可见漩涡状生长。MTT法检测显示本实验培养的第3代兔脂肪干细胞的生长曲线呈典型的S形，符合干细胞的生长规律^[21-22]。

3.2 脂肪干细胞的表型鉴定 关于脂肪干细胞的分子特征，国内外学者对其进行了全面深入的研究，迄今为止尚无研究发现它有特异性的细胞表型标志物，且不同的研究结果并不一致。例如，Gronthos^[23]及Gu等^[24]检测人脂肪基质细胞表面分子表达发现，人脂肪干细胞表达CD34，不表达STRO-1。但是，Zuk等^[25]和Dominici等^[26]的研究结果认为脂肪干细胞不表达CD34。Yoshimura等^[16]认为脂肪干细胞表达CD34、CD90，阴性表达CD31、CD45、CD106、CD146。而Varma等^[27]认为脂肪干细胞表达CD34、CD54、CD90、CD105、CD117、HLA-ABC、HLA-DR，不表达CD31、CD45、CD106、CD146、CD166。Lindroos等^[28]及Baer等^[29]认为供体的不均匀性、脂肪干细胞分离方法与质量、抗体来源、检测方法的敏感性、细胞培养条件、细胞鉴定代数可能是导致研究结果不一致的原因。另外，学者们一直在探索脂肪干细胞新的细胞表型标志物。Xiao 等^[30]利用流式技术从小鼠脂肪基质细胞中分选出Lin^-CD271⁺Sca-1⁺细胞亚群，发现此细胞亚群在体内和体外实验中都能够向脂肪细胞、成骨细胞分化，认为Lin，CD271，Sca-1可以作为纯化脂肪干细胞的特异性标志物。

实验选用具有鉴别意义的细胞表型标记物CD29，CD44，CD45作为兔脂肪干细胞的鉴定^[31-32]。流式细胞仪检测显示P3兔脂肪干细胞均高表达CD29、CD44，阳性率超过90%；CD45阳性率低于5%，与文献[33]报道的研究结果基本一致。

3.3 脂肪干细胞的多向诱导分化 由于尚未发现脂肪干细胞特有的细胞表型标志物，流式细胞仪检测的结果对鉴定脂肪干细胞只有辅助意义，目前多采用表面标志物和多向诱导分化相结合的方法进行脂肪干细胞的鉴定。脂肪干细胞在特定条件下具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力，其分化能力受多方面因素的影响：①脂肪干细胞的成脂能力决定于白脂肪组织的来源，年龄、性别和代谢情况等供体的特征^[34]。如在标准的体外成脂诱导条件下，来源于皮下脂肪的脂肪干细胞比来源于内脏的脂肪干细胞向成熟脂肪细胞的分化能力强^[35]。②脂肪干细胞的分化能力与脂肪干细胞中的细胞亚群有关。Suga等^[36]将人脂肪干细胞分为CD34^-细胞亚群、CD34⁺细胞亚群，通过比较分化能力发现CD34^-细胞亚群比CD34⁺细胞亚群向脂肪细胞和成骨细胞的分化能力更强。③细胞培养瓶涂层上的胶原蛋白或者纤连蛋白影响间充质干细胞的分化率^[37]。

实验采用成脂、成骨诱导分化来进一步观察培养细胞的干细胞特性。成脂诱导2周时油红O染色，细胞内出现大量的红染颗粒，对照组细胞无明显变化，证实培养的细胞能够向脂肪细胞分化。成骨诱导2周时茜素红染色阳性，证实培养的细胞能够向成骨细胞分化。这与文献[38]报道的结果基本一致。

结论：实验证实采用脂肪组织块贴壁法能获得兔脂肪干细胞。此分离方法具有以下优点：①操作步骤少，实验处理时间短。②剪碎兔脂肪组织后用PBS清洗糜状组织，经离心后取组织块接种，可去除过于细小脂肪粒。③分离过程中不使用胶原酶或者胰蛋白酶，也不使用细胞因子，分离成本低。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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